А. СТАДИИ СИНТЕЗА БЕЛКА Генетическая информация транслируется в процессе синтеза белка, в котором аминокислоты полимеризуются в соответствии с порядком, определяемым последовательностью нуклеотидных триплетов мРНК- Последовательность мРНК в свою очередь определяется последовательностью нуклеотидов специфических участков ДНКПроцесс синтеза белка можно разделить «а две основные стадии: 1) активация и узнавание аминокислот и связывание их с соответствующими тРНК и 2) полимеризация аминокислот на рибосомах.

1. АКТИВАЦИЯ И УЗНАВАНИЕ АМИНОКИСЛОТ Для каждой аминокислоты имеется специфический фермент. ами'Ноацил-тРНК, - синтетаза, катализирующий образование сложноэфирной связи между карбоксильной группой аминокислоты и гидроксильной группой последнего нуклеотида соответствующей специфической тРНК. Энергию, необходимую для образования этой связи, поставляет АТР. В результате аминокислота оказывается в активированном состоянии, и энергии сс сложноэфиряой связи достаточно для образования пептидной связи. Процесс связывания аминокислоты с тРНК строго специфичен; эта специфичность обеспечивается аминоацил-тРНК - синтетазой. В результате образуются молекулы аминоацил-тРНК- У бактерий специфическая аминоацил-тРНК формилн-руется по аминогруппе и превращается в тРНК, начинающую процесс полимеризации (инициирующая тРНК).

а. Стадия инициации Синтез начинается с образования комплекса между информационной РНК, инициирующей тРНК и ЗОБ-субчастицей рибосомы. Затем с этим комплексом связывается 50Б-субчастица, завершая образование рибосомы. Инициирующая тРНК связывается с первым триплетом РНК (AUG) ,в участке А на рибосоме. Перемещение рибосомы (траислокация), для которого необходима энергия, обеспечиваемая GTP, приводит к перемещению тРНК в другое положение (называемое участком Р), и участок А снова освобождается (рис. 3.13, А).

б. Стадия элонгации Новая аминоацил-тРНК присоединяется к участку А, используя энергию гидролиза GTP; этот процесс катализируется белками, называемыми факторами элонгации (рис. 3.13,5). В этот момент к рибосоме прикреплены две аминоацил-тРНК в участках А и Р, связанные со специфическими триплетами мРНК. Сложноэфирная связь между аминокислотой и тРНК на участке Р разрывается, и свободная карбоксильная группа образует пептидную связь с аминокислотой, связанной с тРНК на участке А. Эта реакция катализируется ферментом пептидил-трансферазой, который является одним из белков 50Б-субчасти-цы. Освободившаяся тРНК покидает рибосому, и участок Р освобождается. Снова происходит транслокация рибосомы, перемещающая исходную цепь (пептидил-тРНК) с участка А на участок Р, и с участком А может связаться новая аминоацил-тРНК. Этот процесс многократно повторяется по мере удлинения пептидной цепи.

в. Терминация Элонгация продолжается до тех пор, пока рибосома не достигнет специфического триплета информационной РНК, который служит сигналом терминации (рис. 3.13,5). В этот момент комплекс пептидил-тРНК-рибосома - мРНК диссоциирует, и начинается новый цикл. В процессе терминации, по-видимому, участвуют также белковые факторы терминации.

Б. ОБЩИЕ СВОЙСТВА ИНГИБИТОРОВ СИНТЕЗА БЕЛКА Антибиотики подавляют синтез белка за счет различных механизмов и на разных уровнях. Обычно их действие на клетку не идентично, тем не менее можно сделать некоторые обобщения.

1. Временная остановка синтеза белка сама по себе не явля-

Рис. 3.13. Синтез белка на рибосомах. [Из работы Vergnano М., Sassella D. (eds), Rassegna Medica, Milan, Italy, Gruppo Lepetit, Spa., 1973, с изменениями.]

ется гибельной для клетки. Действительно, такое явление наблюдается, например, при истощении в бактериальной культуре необходимых источников питания. Поэтому ингибиторы синтеза белка обладают бактериостатическим действием, если только они не связываются необратимо с какими-либо необходимыми компонентами системы синтеза; в этом случае они обладают бактерицидным действием.

2. Остановка синтеза белка сказывается на синтезе других макромолекул по-разному (рис. 3.14): а) уже начавшаяся репликация ДНК продолжается до завершения синтеза хромосомы, однако новый цикл репликации не инициируется; б) синтез РНК тоже продолжается какое-то время и в некоторых случаях, когда антибиотик действует на уровне рибосом, может даже стимулироваться, однако, если антибиотик подавляет образование аминоацил-тРНК, у многих бактерий помимо остановки синтеза

Рис. 3.14. Влияние хлорамфеникола на включение радиоактивных предшественников в ДНК, РНК, белок и клеточную стенку растущих бактерий. Сплошные кривые - контроль, штриховые - включение метки в культуре, к которой добавлен антибиотик. Время добавления антибиотика отмечено стрелкой.

белка в результате побочного действия антибиотика останавливается и синтез РНК; в) скорость синтеза клеточной стенки снижается, и в конце концов синтез прекращается.

3. Синтез белка у всех организмов протекает более или менее одинаково. Однако некоторые компоненты биосинтетической системы у представителей разных таксономических групп различаются. Основные различия между клетками прокариот и Эукариот представлены в табл. 3.2.

Таблица 3.2. Различия в механизмах синтеза белка у прокариот и эукариот

Эукариоты

Прокариоты

Величина рибосом Состав рибосом, %:

80 S

70S

белок

60

40

РНК

40

60

Рибосомная РНК

5S, 29S, 18S‘> 5S, 25S, 16S2>

5S, 23S, 16S

Инициирующая амиио-

Met-TPHKi

F-met-тРНКі

ацил-тРНК

Факторы ипшпащш 1 Факторы элонгации /

Разные в этих двух

группах

') Животные. ’2) Растения.

Ингибиторы синтеза белка обладают избирательным действием (В том случае, если они взаимодействуют со структурами или компонентами, присущими лишь отдельным группам организмов, и не обладают избирательностью, если они подавляют функции, общие для всех клеток. Поэтому существуют ингибиторы, избирательно подавляющие синтез белка у прокариот, ингибиторы, избирательно подавляющие синтез белка у эукариот, и ингибиторы, не обладающие избирательностью. Антибиотики, относящиеся к двум последним группам, обычно токсичны, за небольшими исключениями (например, тетрациклияы), описанными ниже. Необходимо также помнить, что некоторые ор-гаяеллы эукариотических клеток, например митохондрии, имеют системы синтеза белка, напоминающие системы синтеза белка у бактерий. Поэтому антибиотики, избирательно действующие на системы прокариот, подавляют синтез белка в таких ор-ганеллах и, следовательно, вызывают побочные эффекты в клетках эукариот.

Если рассматривать антибиотики с точки зрения их действия на определенные участки рибосом, то обычно антибиотики, действующие на участок Р, обладают избирательностью, тогда как антибиотики, действующие на участок А, неспецифически подавляют синтез белка как у эукариот, так и у прокариот.

В. АНТИБИОТИКИ, ПОДАВЛЯЮЩИЕ СИНТЕЗ БЕЛКА Антибиотики, подавляющие синтез белка, составляют большую группу разнообразных по структуре веществ, причем некоторые из них имеют важное значение для медицинской практики. Условно эти антибиотики можно разделить на четыре подгруппы в соответствии с тем, на какую стадию синтеза белка они действуют.

1. Ингибиторы активации аминокислот и реакций переноса.

2. Ингибиторы функций малых субчастиц рибосом (ЗОБ).

3. Ингибиторы функций больших субчастиц рибосом (505).

4. Ингибиторы внерибосомных факторов.

Среди представителей первой подгруппы нет ни одного важного для клиники антибиотика. Одним из таких антибиотиков является боррелидин, ингибитор переноса активированного треонина на соответствующую специфическую тРНК- 1

1, ИНГИБИТОРЫ ФУНКЦИЙ ЗОБ-СУБЧАСТИЦ ЗОЭ-субчастицы рибосом выполняют две главные функции: 1) предоставляют участок для прикрепления мРНК; 2) предоставляют участок для связывания инициирующей амино.ацил-тРНК (М-формилмстиснил-тРНК.) и последующих аминоацилтРНК (акцепторный, или А-участок). Поэтому можно вредно-,, латать, что препараты, взаимодействующие с ЗОБ-субчастицами рибосом, будут подавлять инициацию синтеза белка и блокировать акцепторный участок. Наиболее важные антибиотики, действующие на ЗОБ-субчастицу рибосом, - аминогликозиды и тетрациклины.

а. Стрептомицин и другие аминогликозидные антибиотики

Вывод о том, что стрептомицин нарушает функционирование ЗОБ-субчастиц рибосом, основан на следующих экспериментальных данных: 1) радиоактивный стрептомицин связывается с очищенными ЗОБ-субчастицами п нс связывается с БОБ-субчасти-цами; 2) ЗОБ-субчастицы, полученные из мутантов, устойчивых к стрептомицину, ие связывают радиоактивный стрептомицин; 3) ни одна из функций 50Б-субчастиц не подавляется стрептомицином. Анализ субчастиц рибосом, полученных из устойчивых мутантов, показал, что стрептомицин связывается с белком, названным Р10. Связывание антибиотика с этим белком вызывает изменение А-участка ЗОБ-субчастицы, в результате чего нарушается присоединение аминоацил-тРНК в правильной ориентации.

Другие аминогликозидные антибиотики также связываются с ЗОБ-субчастицей - с участком, близким, но не идентичным участку связывания стрептомицина.

Стрептомицин нарушает считывание информации в бесклеточной системе синтеза белка, т. е. он индуцирует включение ошибочных аминокислот в растущую полипептидную цепь. Одно время считалось, что сильнее бактерицидное действие стрептомицина является следствием синтеза нефункциональных белков. Однако, ПО-ВИДИМО'.му, это утверждение ошибочно, поскольку добавление стрептомицина к растущей культуре вызывает полное прекращение синтеза белка в пределах нескольких минут, т. е. за время, недостаточное для синтеза заметного количества нефункциональных белков. Бактерицидное действие антибиотика является скорее следствием высокого сродства стрептомицина к соответствующему участку рибосомы, что приводит к его необратимому связыванию с рибосомами и к необратимой их инактивации.

б. Тетрациклины О том, что тетрациклины действуют на ЗОБ-субчастицы, свидетельствуют следующие экспериментальные данные: 1) с ЗОБ-субчастицами связывается больше радиоактивного тетрациклина, чем с БОБ-субчастицами; 2) тетрациклин подавляет связывание радиоактивной формилметиончл-тРНК с ЗОБ-субчасти-цей в присутствии инициирующего' кодона AUG; 3) тетрациклин подавляет связывание аминоацил-тРНК с ЗОБ-субчастицами. Поскольку никогда не были получены рибосомы, «устойчивые к тетрациклину», те установлено, на какой именно участок ЗОБ-субчастиц действует антибиотик. В бесклеточной системе тетрациклин подавляет функции малой субчастицы (40S) рибосом эукариот. Однако, как уже отмечалось, он не действует на целые клетки эукариот, и его избирательность основана на различиях в проницаемости клеточных мембран, Тетрациклин концентрируется в клетках прокариот, подавляя их рост, но не может проникать через мембраны эукариотических клеток.

2. ИНГИБИТОРЫ ФУНКЦИЙ SOS-СУБЧАСТИЦ

50Б-субчастицы рибосом выполняют две основные функции: 1) предоставляют участок для связывания пептидил-тРНК (донорный участок, или Р-участок); 2) участвуют в образовании пептидной связи. Как только пептидная связь образовалась, псцтпдпл-тРНК перемещается относительно рибосомы. В результате акцепторный участок освобождается, и с ним может связаться следующая аминоацнл-тРНК (транслокация).

Рассмотрим наиболее важные антибиотики, действующие на 50Б-еубчастицы рибосом.

а. Пуромицин Пуромицин можно рассматривать как структурный аналог З'-копцевого нуклеотида аминоацил-тРНК. Благодаря такому сходству он связывается с акцепторным участком малых субчастиц рибосом как прокариот (30S), так и эукариот (40S). Аминогруппа антибиотика взаимодействует со свободным карбоксильным концом псптидил-тРНК с образованием пептиднл-пуромицина, освобождающегося из комплекса с рибосомой. Синтез белка, таким образом, блокируется на стадии элонгации, и образуются короткие незавершенные пептидные цепи, с карбоксильным концом которых ковалентно связана молекула пуромицин а. Отсутствие избирательности в отношении прокариот по сравнению с эукариотами исключает использование пуромицнна в клинике.

«Пуромициновая реакция», т. е. образование пептидилпуро-мицина, катализируемая 50S-'субчастицами рибосом, широко используется при изучении механизма действия ингибиторов белкового синтеза. Поскольку в ходе пуромициновой реакции обязательно образуется пептидная связь, любой ингибитор образования этой связи вызывает подавление пуромициновой реакции.

Фермент, ответственный за образование пептидной связи

(часто называемый пептидилтрансферазой), является составной частью БОБ- (и бОБ-) субчастиц рибосом. Пуромициновая реакция протекает и в том случае, когда в шей вместо пептидил-тРНК принимают участие пептндилолигонуклеотиды (например, пептидил-СААССА, который эквивалентен З'-фрагменту пептн-дил-тРНК; по этой причине реакцию между пуромицином и пептидил-СААССА можно назвать фрагментной реакцией). Преимущество фрагментной реакции состоит в том, что она ограничена участком БОБ-субчастицы, находящимся в непосредственной близости к каталитическому центру образования пептидной связи, поскольку, с одной стороны, субстраты имеют небольшие размеры, а с другой - отсутствуют участки тРНК., ответственные за взаимодействие с рибосомами. Поэтому подавление фрагментной реакции можно считать указанием та то, что имеет место специфическое действие на каталитический центр образования пептидной связи (пептидилтрансферазу).

б. Макролиды Антибиотики этой группы (среди них наиболее полно изучен эритромицин) подавляют синтез белка, воздействуя на некоторые этапы транслокации или нарушая конформацию пептндил-трансферазного участка. Это заключение основано на следующих фактах. Эритромицин подавляет связывание хлорамфепи-кола с БОБ-субчастицами и связывается с БОБ-субчастицами рибосом, -выделенными из чувствительных бактерий, более прочно, чем с субчастицами из устойчивых штаммов. Показано, что другие макролиды связываются с участком рибосомы, который частично перекрывается с участком связывания эритромицина.

в. Хлорамфеникол Описание механизма действия хлорамфеникола приведено как иллюстрация к логической последовательности экспериментов, которые необходимо поставить для выяснения механизма действия ингибитора синтеза белка.

Хло-рамфеникол специфически подавляет синтез белка в интактных клетках прокариот. Добавление его к растущей культуре чувствительных бактерий вызывает быструю остановку синтеза белка, тогда как синтез ДНК, РНК и пептидоглпкана в течение некоторого времени продолжается почти с 'Неизменной скоростью. Это свидетельствует о том, что синтез белка является первичной мишенью хлорамфеникола.

Заключение о нарушении функций рибосом в присутствии хлорамфеникола ¦ основано на следующих экспериментальных данных: 1) хлорамфеникол подавляет полимеризацию аминокислот в бесклеточной системе, содержащей аминоацил-тРНК, рибосомы, мРНК, растворимые факторы, Л^2+ и йТР; этот эффект исключает возможность действия хлорамфеникола на активацию аминокислот и на реакции переноса и свидетельствует о том, что антибиотик действует или на рибосомы, или на растворимые факторы; 2) радиоактивный хлорамфеникол связывается с рибосомами, следовательно, рибосомы являются его специфической мишенью.

Хлорамфеникол связывается с бОБ-, а не с ЗОБ-субчастицами рибосом. Субчастицы рибосом можно разделить и показать, что препараты очищенных бОБ-субчастиц связывают радиоактивный хлорамфеникол, а препараты ЗОБ-субчастиц не связывают.

Хлорамфеникол подавляет образование пептидной связи. Он является эффективным ингибитором пуромициповой реакции с лейцилацетил-СААССА в качестве субстрата (фрагментная реакция). Следовательно, этот антибиотик должен действовать на пептидилтрансферазу.

Хлорамфеникол связывается с акцепторным участком бОБ-субчастицы. Он подавляет связывание амипоцил-СААССА, но не влияет на связывание пептидил-СААССА. Следовательно, участок связывания хлорамфеникола лежит поблизости от акцепторного (аминоацильного) участка.

г. Линкомицин и клиндамицин Механизмы действия этих антибиотиков очень близки механизму действия эритромицина. Действителыно, наблюдается частичная перекрестная устойчивость к линкомицину и клинда-мицину, с одной стороны, и к эритромицину - с другой. Как и хлорамфеникол, линкомицин действует на участок рибосомы, который по крайней мере частично совпадает с участком связывания эритромицина. Линкомицин блокирует элонгацию пептидной цепи.

3. ИНГИБИТОРЫ ВНЕРИБОСОМНЫХ ФАКТОРОВ Антибиотики этой группы нарушают функционирование растворимых факторов, принимающих участие в биосинтезе белка.

а, Фузидиевая кислота Этот стероидный антибиотик нарушает функционирование фактора элонгации (EF-Q). В присутствии антибиотика стабилизируется тройной комплекс EF-G - GDP-рибосома, транслокация рибосом блокируется, фактор EF-G «замораживается» в тройном комплексе и, следовательно, не может участвовать в следующем цикле траислокациии (рис. 3.13). Это заключение основано на следующих экспериментальных фактах: 1) радиоактивная фузидиевая кислота связывается с очищенным фактором EF-G (в молярном отношении 1:1); 2) антибиотик подавляет зависимую от рибосом ОТРазную активность фактора EF-G; 3) фактор EF-G, выделенный из мутантов Е. coli, устойчивых к фузидиевой кислоте, обладает GTP-азной активностью, устойчивой к действию антибиотика. Фузидиевая кислота оказывает такое же подавляющее действие на фактор элонгации EF-2 эукариот. Избирательность этого антибиотика in vivo в отношении прокариот (в основном грамположительных бактерий) основана на избирательной проницаемости клеточной мембраны этих организмов.

6. Кирромицины Недавние исследования показали, что антибиотики этой группы подавляют процесс элонгации в результате связывания с фактором элонгации Tu (EF-Tu), который, в частности, ответствен за правильное расположение тРНК на рибосомах. Связывание антибиотиков с этим фактором индуцирует аллостерическое изменение структуры фермента, сказывающееся на всех реакциях, которые ведут к образованию комплекса аминоацил-тРНК-EF-Tu-GTP.

Мы благодарны автору и издательствам, которые не противодействует, а способствует образованию медицинских работников.
В случае нарушения авторских прав, пожалуйста, напиши нам и материалы будут незамедлительно удалены!